安捷伦液相色谱仪检测器原理之荧光检测器
荧光检测器(Fluorescence Detector,简称FLD)是高压液相色谱仪常用的一种检测器。之前我们讲到的紫外检测器是以氘灯为主要光源，而我们使用的FLD检测器，则是以氙灯作为主要光源，通过电火花放电使氙气发生激发态和离子态的能级跃迁并发光。
用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。它是基于物质的荧光特征，即某些化合物在特定波长的光激发下，能够发射出波长较长的荧光。
这是一种化学发光，是指激发态分子从激发态回到基态时发生的现象。当激发能是光时，这一过程叫做光致化学发光。
基本来说，光的发射是吸收的反过程。当比较复杂的分子从基态到激发态，吸收的能量分布到各个振动和转动能级，此时这个分子回到基态，首先失去振动和转动能成为弛豫状态，不产生辐射。然后，这个分子从这一能级转换到基态的各个振动和转动能级，有光辐射出现。如图，一个物质的最大吸
收为λEX，激发为λEM。
光致化学发光是荧光和磷光这两种现象的统称。两者的特性差异在于分子被激发后的发射延迟不同。如果分子被照射之后发光10^-9到10^-5s，把这一过程叫做荧光，光灭较快；如果分子被照射之后发光时间在大于10^-3s，这一过程叫做磷光，光灭较慢。
如上图，可以观察到荧光检测器光学系统的所有元件，其辐射源为氙灯，此灯以3μs的闪烁频率发出200nm-900nm的连续光谱。当上盖被打开时，可以感受到此灯非常烫，一定要小心。光栅利用三相无刷直流电机转动，决定了光落到流通池上的波长范围。光栅的表面有许多微小的凹槽，每毫米有1200个凹槽，千万不要用手直接接触。流通池是由固体熔融石英体做成，可承受最大20bar的背压，这个石英流通池非常脆弱，所以不建议用大流速或高粘度的流动相冲洗它。在流通池后面有一个参比二极管，它用来测量穿过流通池的激发光并校正闪光灯的波动和强度造成的漂移。
用原理图，我们再来理解荧光检测器的工作原理。氙灯发光通过聚光透镜将光线聚集并穿过EX狭缝，并通过反射镜照射到EX光栅，此时的光线由很宽的带宽，到光栅后，光栅旋转，光栅的位置决定了激发光的波长。被选定波长后的激发光照射流通池，透过流通池的激发光到达参比二极管。流通池内的样品被激发光照射后产生荧光，在流通池内被反射至EM光栅。经过发射光栅，选择特定波长的发射光又经光电倍增管的增强后，得到最终我们看到的信号。
荧光检测器具有以下特点：
· 高灵敏度和定量性：比紫外检测器高约两个数量级，可达到10^(-13)g的小检测量。可以检测到微弱的荧光信号，并能够定量分析，是一种适用于痕量分析的高灵敏度液相色谱检测器。
· 良好的选择性：可以有效避免不发荧光成分的干扰，保证分析的选择性。
· 宽线性范围：相对于大多数痕量分析来说线性范围已经足够宽广，可以在低浓度和高浓度范围内实现线性响应。但在分析物质浓度较大时，可能会受到内滤效应的影响而导致发射度降低。
根据荧光检测器的特性，在操作时需要注意：
· 溶剂纯度：避免荧光杂质干扰。
· 波长优化：根据化合物光谱选择最佳激发/发射波长。
· 基线稳定：温度、流速需恒定，减少噪声。
· 衍生化：对非荧光物质（如脂肪酸）进行荧光标记。
尽管荧光检测器也可以做类似DAD的全波长扫描，在灵敏度和选择性上表现出色，但其线性范围较窄，且不是所有化合物都具有荧光性，这限制了它的通用性。相比之下，紫外/可见光检测器虽然灵敏度较低，但适用范围更广。
基于荧光检测器在分析领域具有高灵敏度、良好的选择性和宽线性范围等特点，广泛应用于生命科学领域和其他需要痕量分析的领域，为科学研究和应用提供可靠的分析工具。
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